surePAGE預(yù)制膠使用指南及答疑集錦
發(fā)布時間:2020-12-10 07:57:24 點(diǎn)擊:
FAQ:1. {C}surePAGE
預(yù)制膠在使用前需要特別處理嗎?預(yù)制膠產(chǎn)品打開包裝即可用于蛋白電泳實(shí)驗(yàn),但
請一定撕掉膠板底部綠色封口膠帶。 并請檢查電泳槽密封條是否需要翻轉(zhuǎn),以保證內(nèi)槽密封。
2. {C}surePAGE
預(yù)制膠能否用于非變性電泳?可以用于非變性電泳。非變性電泳由于受蛋白質(zhì)的亞基及電荷量少的影響,存在條帶偏移率低(泳動速度慢)、條帶不夠鋒利等現(xiàn)象。由于非變性電泳時間較長,請根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)先進(jìn)行電泳條件優(yōu)化。
3. {C}
應(yīng)該使用什么電泳緩沖液?推薦使用MOPS電泳緩沖液。對于小分子量蛋白,請使用MES緩沖液。請勿使用Tris甘氨酸電泳緩沖液。
4. {C}
跑完一塊膠需要多久?電泳時間取決于選取的電泳緩沖液、凝膠濃度以及興趣蛋白的分子量大小。在MOPS電泳緩沖液,140V恒壓條件下,電泳時間通常是50分鐘。一片凝膠電泳時,初始電流大約在70-100mA。適當(dāng)提高電泳儀輸出電壓設(shè)定,可以縮短電泳時間。但高電壓會引起電泳實(shí)驗(yàn)體系溫度上升,導(dǎo)致電泳過程出現(xiàn)不可預(yù)料的情況。不推薦超過180V的電壓設(shè)定。
5. {C}
surePAGE預(yù)制膠可以用于哪些電泳槽?只要是兼容10 x 8 cm或10 x 10 cm 丙烯酰胺凝膠的垂直型電泳槽, 預(yù)制膠都有良好的兼容性。
6. {C}
為什么在蛋白轉(zhuǎn)印時凝膠變的很粘?低濃度凝膠質(zhì)地較軟,轉(zhuǎn)膜時易受熱,與轉(zhuǎn)印膜粘連。
7. {C}
其他公司的出品的染料是否可以用于surePAGEf預(yù)制膠染色?每家公司的蛋白染料產(chǎn)品配方不同。以考馬斯亮藍(lán)G250或R250為主要成分的染色液與本預(yù)制膠產(chǎn)品兼容性較好。
8. {C}
過夜脫色會影響條帶的銳度嗎?不同的脫色液配方會影響脫色效果。推薦用于過夜脫色的脫色液配方是:15%乙醇,10%乙酸的水溶液。
9. {C}
SurePAGE預(yù)制膠在室溫下穩(wěn)定嗎?SurePAGE預(yù)制膠在室溫下可以保存6個月。為獲得最佳實(shí)驗(yàn)效果,請2-8℃保存。
10. {C}
如何使用傳統(tǒng)染色脫色方法處理預(yù)制膠?A. 考馬斯亮藍(lán) R-250 使用微波爐染色:1) 配制染色液:在40%乙醇和10%醋酸溶液中溶解終濃度為0.1%(W/V)的考馬斯亮藍(lán)R-250。
2) 配制脫色液:將終濃度為10%(V/V)乙醇、7.5%(V/V)醋酸溶解在一起。
3) 電泳完成后,撬開膠板取出凝膠,然后放入裝有100 ml染色液的染色容器中。
4) 蓋上容器蓋子并放入微波爐中用高熱檔位加熱8分鐘。為了避免危險(xiǎn),請注意不要讓溶液沸騰。
5) 從微波爐中取出染色容器,放在脫色搖床上常溫輕搖5分鐘。
6) 倒掉染色液并用去離子水小心清洗凝膠。
7) 倒掉去離子水,并加入100 ml脫色液。
8) 蓋上蓋子,放入微波爐中用高熱檔位加熱8分鐘。
9) 倒掉脫色液,加入新的脫色液,重復(fù)步驟8。
10) 從微波爐中取出,放在脫色搖床上常溫輕輕震蕩至背景清晰。
B. 考馬斯亮藍(lán) R-250 常規(guī) 染色:1) 配制染色液:在40%乙醇和10%醋酸溶液中溶解終濃度為0.1%(W/V)的考馬斯亮藍(lán)R-250。
2) 配制脫色液:將終濃度為10%(V/V)乙醇、7.5%(V/V)醋酸溶解在一起。
3) 電泳完成后,撬開膠板取出凝膠,然后放入裝有100 ml染色液的染色容器中。
4) 放于搖床上輕搖1小時。
5) 倒掉染色液并用去離子水小心清洗凝膠。
6) 倒掉去離子水,并加入100 ml脫色液。
7) 放于搖床上輕搖1小時。
8) 更換新鮮脫色液,繼續(xù)放于搖床上脫色1小時。
9) 重復(fù)步驟7、8一次。
10) 更換新鮮脫色液,放于搖床上過夜脫色至次日背景清晰。
疑難解答
問題 |
可能原因 |
解決方法 |
條帶變形 |
上樣孔中有氣泡 或者有凝膠保存緩沖液 |
加注電泳緩沖液前后,使用注射器吸取緩沖液輕輕沖洗上樣孔,將氣泡吹出。 |
樣品蛋白濃度過高 |
使用上樣緩沖液稀釋蛋白樣品。 |
條帶拖曳、滯孔 |
樣品中含有較大顆粒雜質(zhì)如細(xì)胞碎片、菌體碎片) |
高速離心后,取上清液電泳。 |
蛋白樣品(如包涵體蛋白) 未充分溶解 |
在樣品中添加額外的十二烷基硫酸鈉硫酸鈉(SDS)或者使用上樣緩沖液稀釋樣品。 |
高濃度條帶出現(xiàn)在相鄰泳道 |
上樣時,樣品溢出到相鄰條帶 |
降低上樣量。發(fā)現(xiàn)溢出時使用緩沖液沖洗上樣孔。 |
上樣孔破損 |
移除制孔梳時加倍小心。發(fā)現(xiàn)上樣孔破損后換用新的凝膠。 |
膠板變形 |
在安裝預(yù)制膠時先移除制孔梳,再固定在電泳槽內(nèi)。 |
使用墊片、翻轉(zhuǎn)密封條時注意是否會對凝膠產(chǎn)生過大的壓力,導(dǎo)致凝膠變形。 |
凝膠變干,上樣孔萎縮 |
打開包裝后,防止凝膠干燥。 |
為防止凝膠變干,可以盡快裝置到電泳槽內(nèi),并加注電泳緩沖液。 |
懷疑凝膠變干時,可將凝膠在電泳緩沖液中浸泡一段時間,待凝膠恢復(fù)形狀后上樣。 |
泳道整體成外“八”字形 |
膠板變形 |
安裝預(yù)制膠時先移除制孔梳,再固定在電泳槽內(nèi)。 |
使用墊片、翻轉(zhuǎn)密封條時注意是否會對凝膠產(chǎn)生過大的壓力,導(dǎo)致凝膠變形。 |
條帶遷移速度過慢 |
凝膠底部綠色膠帶未移除 |
移除綠色密封膠帶。 |
凝膠安裝不當(dāng),電泳槽內(nèi)槽漏液(與外槽有溶液聯(lián)通現(xiàn)象) |
檢查內(nèi)槽密封條、墊片等附件是否安裝恰當(dāng)。 |
確認(rèn)凝膠安裝位置,重新安裝凝膠。 |
電壓設(shè)置有誤,或者使用了不當(dāng)?shù)碾娪揪彌_液 |
推薦使用140V恒壓條件電泳。 |
推薦使用正確濃度的MOPS電泳緩沖液 |
蛋白條帶前沿模糊 |
離子干擾(小分子蛋白電泳容易出現(xiàn)此現(xiàn)象) |
換用MES電泳緩沖液。 |
蛋白條帶前沿變黃 |
電泳緩沖液性能下降,pH降低 |
換用新鮮配制的電泳緩沖液。 |
蛋白分離效果不佳 |
凝膠濃度選擇不當(dāng) |
根據(jù)凝膠最佳分離范圍選用不同濃度凝膠。 對于小分子蛋白的分離,請選用較高分離膠濃度的預(yù)制膠產(chǎn)品或者換用專門為小蛋白開發(fā)的預(yù)制膠產(chǎn)品。 |
樣品蛋白量超出凝膠分離能力 |
降低上樣量,將總蛋白量控制在60 μ g以內(nèi) |
樣品含鹽量過高 |
使用透析、超濾,或者稀釋的方法降低鹽濃度后電泳。 |
電泳體系溫度過高 |
提高電泳緩沖液用量。 |
或者使用冰袋對緩沖液降溫降溫、在低溫環(huán)境中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)等方法改善效果。 |
MOPS電泳緩沖液性能無法達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求 |
換用MES電泳緩沖液進(jìn)行嘗試。 |
8%的膠在轉(zhuǎn)膜時粘在膜上 |
凝膠濃度低、質(zhì)地較軟,轉(zhuǎn)膜時易受熱,與轉(zhuǎn)印膜粘連 |
添加冰袋、或在低溫環(huán)境中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),控制轉(zhuǎn)膜溫度。 |
非變性電泳時條帶模糊 |
非變性電泳由于受蛋白質(zhì)的亞基及電荷量少的影響,存在涌動速度慢、條帶不夠鋒利等現(xiàn)象 |
優(yōu)化電泳緩沖液配方。 |
保證蛋白帶有足夠的電荷量。 |
同時注意是否需要調(diào)整電泳儀電源正負(fù)極。 |