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surePAGE預制膠使用說明書

發(fā)布時間:2020-12-09 07:47:10 點擊:
簡介:
SurePAGE 預制膠是Express Plus 的升級產(chǎn)品,它是一款高性能的小型聚丙烯酰胺凝膠,能滿足客戶上樣量大的需求。其獨特的膠板設計可以提高條帶分辨率,改善樣品在上樣孔里的分布狀態(tài),使得條帶更加均勻。該預制膠為Bis-Tris 凝膠緩沖系統(tǒng),比常規(guī)的 Tris-Glycine 系統(tǒng)具有更強的緩沖能力, 于pH6.4 的弱酸性條件下灌注,能夠更好地減少聚丙烯酰胺的降解,提高凝膠穩(wěn)定性。
SurePAGE 預制膠不含有 SDS,依賴于采用合適的電泳緩沖液和相應試劑,是 SDS-PAGE 和非變性凝膠電泳的理想材料。依賴特有的灌注技術可以保證預制膠批次間穩(wěn)定性和條帶分布一致性。SurePAGE 預制膠配套使用 Tris-MOPS 或 Tris-MES 電泳緩沖液,能夠實現(xiàn)高效、可靠地分離蛋白質(zhì),便于后續(xù)染色或轉膜檢測。
SurePAGE 預制膠提供不同濃度的梯度膠和固定濃度膠。梯度膠的濃度包括4-20%、4-12% 和8- 16%;固定濃度膠包括8%、10%和12%。每種濃度的預制膠都有10個點樣孔、12個點樣孔和15個點樣孔三種規(guī)格。膠板尺寸:長×寬×高為100 × 80 ×4.7 mm;凝膠尺寸:長×寬×厚為80×70×1 mm。
 主要特點:
  1. 上樣量大 — 最大上樣量可達80 μl, 高于其他公司同類產(chǎn)品
  2. 簡單易用 — 特殊上樣口設計,使用普通10 μl 移液槍頭快速上樣
  3. 高分辨率 — 蛋白條帶分離更為清晰和均一
  4. 超長保質(zhì)期 —2-8 ℃可保存12個月
  5. 兼容性膠板設計 — 適合大多數(shù)小型電泳槽
  6. 重復性高 —不同批次預制膠的一致性好
  7. 物美價廉 — 節(jié)約實驗成本

1、凝膠選擇指導


表1. 凝膠選擇指導
 
產(chǎn)品編號 丙烯酰胺濃度 孔數(shù) 上樣孔體積 電泳緩沖液 轉移緩沖液 分離范圍
M00661 8% 10 80 μl MOPS, MES Tris-Bicine 180-20 kDa
M00664 10% 10 80 μl MOPS, MES Tris-Bicine 160-20 kDa
M00667 12% 10 80 μl MOPS, MES Tris-Bicine 120-6.5 kDa
M00655 4-20% 10 80 μl MOPS, MES Tris-Bicine 250-10 kDa
M00658 8-16% 10 80 μl MOPS, MES Tris-Bicine 160-10 kDa
M00652 4-12% 10 80 μl MOPS, MES Tris-Bicine 250-20 kDa
M00662 8% 12 60 μl MOPS, MES Tris-Bicine 180-20 kDa
M00665 10% 12 60 μl MOPS, MES Tris-Bicine 160-20 kDa
M00668 12% 12 60 μl MOPS, MES Tris-Bicine 120-6.5 kDa
M00656 4-20% 12 60 μl MOPS, MES Tris-Bicine 250-10 kDa
M00659 8-16% 12 60 μl MOPS, MES Tris-Bicine 160-10 kDa
M00653 4-12% 12 60 μl MOPS, MES Tris-Bicine 250-20 kDa
M00663 8% 15 40 μl MOPS, MES Tris-Bicine 180-20 kDa
M00666 10% 15 40 μl MOPS, MES Tris-Bicine 160-20 kDa
M00669 12% 15 40 μl MOPS, MES Tris-Bicine 120-6.5 kDa
M00657 4-20% 15 40 μl MOPS, MES Tris-Bicine 250-10 kDa
M00660 8-16% 15 40 μl MOPS, MES Tris-Bicine 160-10 kDa
M00654 4-12% 15 40 μl MOPS, MES Tris-Bicine 250-20 kDa

下圖的蛋白遷移表可以幫助您選擇合適的凝膠進行蛋白電泳

2、.可兼容電泳槽

SurePAGE 預制膠可兼容以下電泳槽:

3、SurePAGE 預制膠的使用簡介

A.電泳緩沖液和電泳槽的準備

  1. 取一包電泳緩沖液粉末 (Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder,產(chǎn)品編號:M00138) 溶解在 1 L 的去離子水中制成 1×電泳緩沖液。
  2. 將 SurePAGE 預制膠從包裝袋中取出,撕掉膠板底部的膠帶(見圖 1)
  3. 平穩(wěn)地將梳子從膠板中推出(見圖 2)
  4. 將膠板放入凝膠電泳裝置中。請參閱電泳裝置制造商的使用說明。  Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra System 電泳槽的使用注意事項: 將電泳槽內(nèi)框架的綠色硅橡膠密封條取出,然后將其平坦的一面朝外并重新插回內(nèi)框架的凹槽中(見圖3)。
          
         圖3. SurePAGE 預制膠在Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra System 電泳槽中的使用


圖 4. SurePAGE 預制膠在 Bio-Rad 電泳槽的使用

5、在電泳槽的內(nèi)槽中倒入足夠的 1× MOPS 或 MES 電泳緩沖液使其覆蓋上樣孔 5-7 mm,在外槽中加入相同的電泳緩沖液以確保適當?shù)睦鋮s。為了獲得最好的效果,外槽的緩沖液需要加到與內(nèi)槽持平的位置或稍低,但不可漫過膠板(注意:1. 相對于 MOPS 電泳緩沖液來說,MES 更適合用于小蛋白的分離;2.Tris-Glycine 電泳緩沖液與SurePAGE 預制膠的 Bis-Tris 緩沖系統(tǒng)不兼容, 請不要使用。
6、使用注射器或其他工具吸取適量 1×的電泳緩沖液,將上樣孔輕輕沖洗干凈,去除氣泡和殘留的儲存緩沖液。

B.樣品的制備

SDS-PAGE凝膠電泳
5x Loading Buffer配方
SDS 1.0 g
甘油 5.0 ml
溴酚藍 25 mg
Tris base 150 mg
β-巰基乙醇 1.0 ml
去離子水 (使用 8 M NaOH或8 M HCl調(diào) pH 至6.8) 加至10 ml
 
10x MES 電泳緩沖液配方:
Tris base 60.6 g
MES 97.6 g
SDS 10 g
EDTA 3 g
去離子水 (使用8 M NaOH或8 M HCl調(diào)pH至7.3) 加至1000 ml
10x MOPS 電泳緩沖液配方:
Tris base 60.6 g
MOPS 104.6 g
SDS 10 g
EDTA 3 g
去離子水 (使用8 M NaOH或8 M HCl調(diào)pH至7.3) 加 至 1000 ml
樣品處理:
蛋白樣品 x μl
蛋白樣品緩沖液 (5x) 2 μl
去離子水 加 至 10 μl
上樣前將樣品加熱至100℃,十分鐘。

非變性PAGE凝膠電泳
SurePAGE 預制膠的pH為6.4,SurePAGE 不含SDS 可用于酸性蛋白(pI<6.4)的非變性電泳,但不能用于堿性蛋白的非變性電泳。要想獲得理想的電泳結果,需要您對樣品蛋白的結構做分析, 對電泳時間和電泳緩沖液的pH做一個摸索。
5x sample buffer:
甘油 5.0 ml
溴酚藍 25 mg
Tris base 150 mg
去離子水 (使用8 M NaOH 或8 M HCl 調(diào)pH至6.8) 加 至 10 ml
1x MES 電泳緩沖液配方:
Tris base 6.06 g
MES 9.76 g
EDTA 0.3 g
去離子水
(使用8 M NaOH 或8 M HCl 調(diào)pH 至7.3)
加至1000 ml
10x MOPS 電泳緩沖液配方:
Tris base 60.6 g
MOPS 104.6 g
EDTA 3.0 g
去離子水 加至1000 ml
注意事項:金斯瑞提供的電泳緩沖液粉末(Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder,目錄號: M00138)含有SDS,所以不適合非變性電泳。
樣品處理
樣品 x μl
蛋白樣品緩沖液(5x) 2 μl
去離子水 加至10 μl
不要加熱。

電泳過程:
讓上樣槍頭的尖端垂直插入到上樣孔中能夠獲得最佳的上樣效果,槍頭不能戳破膠體,更不能使膠板變形導致樣品漏孔(見圖5)

注意事項:最佳上樣量必須通過實驗來確定,樣品過量會導致條帶的拖尾和失真。加入過量的含自由狀態(tài)碳水化合物的蛋白,可能會導致條帶變形或者蛋白無法穿入膠中(見故障診斷)。
將電泳槽蓋子蓋好,并將電源線插頭插入電泳儀電源插孔(紅對紅,黑對黑),在140 V  電壓下電泳 45-55分鐘直至溴酚藍條帶跑到凝膠底部(見表3)。
電壓 開始電流 結束電流 電泳時間*
140 V 75-100 mA 30-50 mA 45-55 分 鐘
*凝膠的電泳時間取決于實驗室的溫度,這些電泳時間是依據(jù)實驗室中20℃的MOPS、MES緩沖液得來的

重要注意事項:

  1. 確保使用兼容的電泳槽,內(nèi)外槽之間液體的泄漏會導致低遷移率(見故障診斷)。
  2. 電泳時間可能會改變,取決于電源和凝膠濃度。
 

從膠板中取出凝膠(見圖6)

  1. 電泳結束后,根據(jù)電泳槽制造商的使用說明從電泳槽中取出預制膠。
  2. 通過撬具或其他合適的工具小心的插入到膠板之間的空隙。
  3. 用撬具慢慢地上下撬動膠板,重復上述操作,撬動上、中、下三個不同的位置,直至膠板兩側被完全分開。注意小心并最好佩戴護目鏡,以免發(fā)生人身傷害。
  4. 打開之后,凝膠可能粘在膠板的任意一側,將無凝膠的膠板取下,將有凝膠的膠板上有膠一側浸入水中貼著水面,膠板傾斜輕輕提起,凝膠掉入水中后,將凝膠從水中取出進行染色(使用后的膠板和梳子請以醫(yī)療垃圾或實驗廢棄物處置,不可投入生活垃圾桶中)。

圖6. 打開膠板取出凝膠
 
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